前文提要簡介了細胞培養以及檢測方法
今天要來講細胞繼代，繼代在美國與歐洲普遍使用的英文略有差異，前者為subculture後者為passage
在哈里森細胞培養論文發布以前二十年，1885年勞斯(Wilhelm Roux)以生理食鹽水培養雞胚胎細胞長達13天，算是首次在體外培養細胞的紀錄，
約同時間1882年弗萊明(Walter Flemming)發表了細胞分裂的著作，隨著遺傳學與細胞學一步一步的結合到了20世紀五零年代抗凍劑(DMSO、glycerol)與培養液(FBS)標準化，
細胞培養技術漸漸成熟，相關理論也於六零年代以後得以實踐，包括後來的複製羊桃莉等將於下文介紹，本文就基礎繼代培養方法著手描述。
常見的細胞培養株以小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryo fibroblast)與人類癌細胞為主，處不同環境、階段的細胞生長週期不同，
快則像癌細胞、胚胎幹細胞數十分鐘複製一次，慢則像體細胞約一天複製一次。細胞定期間隔(regular intervals)以對數生長，
大概長至培養皿面積的70~90%滿度(confluency)就需要進行繼代，因為細胞不像細菌生長能漂浮於培養皿中，他們需要貼附物質(clarity polystyrene)才能生長。
培養通常是由前文說的MCB、WCB進行繼代，繼代的過程分為三大程序: 1.細胞繼代培養 2.冷凍保存 3.解凍與活性檢測
1.細胞繼代培養(subculture)
配置好培養液DMEM (Dulbecco's modified Minimal Essential Medium, 配置時會加phenol red酸性時呈黃色以及penicillin 和 streptomycin做抗生素，常溫)
以及PBS緩衝液(phosphate buffer saline,食鹽為主,常溫)以及0.05%胰蛋白酶(trypsin，常溫)
首先將細胞取至生物安全櫃BSC中吸去皿中原培養液，並添加8~10ml的PBS進行沖洗(約半分鐘讓細胞稍微適應環境)後吸去PBS並添加1 ml的trypsin，
tyrpsin本身對細胞除了能去除integrin與polysyrene的鍵結外也有部分毒性不可作用太久。依照細胞附著性混合均勻後等待5~10分鐘後吸去trypsin。
添加8~10ml的DMEM後放入離心機以300g*5分鐘，最好能維持常溫。離心完後會看到下面有一塊組織，去除組織上清液後加入8~10ml DMEM進行pipetting。
吸取全部的溶液依需求濃度添加至新的plate上，放回BSC中繼續培養。
2.冷凍保存(Frozen cell)
準備好DMSO(dimethy sulphoxide)，DMSO與glycerol為抗凍劑能減緩冷凍時形成大塊冰晶造成細胞受損。
延續繼代培養離心後的步驟，將上清液吸除後，加入1~1.5ml的DMSO，小心的pipetting細胞，放入準備好的cryovial tube
放入預備冷卻箱(cryo-freezing container)放入冷凍庫-80度一天後再放入液態氮桶內保存。
另外離心前可取少量混合液與trypan blue等量混合置入hemocytometer中計數細胞數量。
3.解凍與活性檢測(thawing frozen cell & cell analysis)
準備好培養液DMEM(預冷)、WST-1試劑、37度水浴槽
將欲解凍tube盡快放入37度水浴槽約兩分鐘迅速解凍，tyrpsin在低溫4度時對細胞毒性相對低，盡快使細胞脫離trypsin，
吸取全部1ml的溶液至裝滿9mlDMEM培養液中進行離心300g*5分鐘，去除上清液後將8ml 培養液pipettin細胞，
吸取所有溶液加入新的plate或flask中進行培養。
活性檢測使用WST-1可偵測NAD+的含量，其越多越易成暗紅色，NAD+為代表粒線體活性進而推斷細胞活性。
且不同細胞週期的細胞活性也不同。將空白與不同濃度的稀釋液加入96孔盤放入測光儀偵測450nm的反應，得知細胞活性。
小結，以前記得有次離心完後的細胞整管都是沒有沉澱的狀態，那次好像rpm轉太快了造成所有細胞爆裂，
操作時每個環節要小心翼翼，之後會介紹細胞週期與細胞複製。
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